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本生一秒帶您看懂——酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是的標(biāo)記免疫分析技術(shù)之一。
它基于一種酶標(biāo)記抗體，能夠檢測固定在96孔或384孔酶標(biāo)板上的抗原，加入的底物可以產(chǎn)生與原始樣品中存在的抗原量相關(guān)的顏色變化或光信號。這是一種簡單而快速的技術(shù)，用于檢測附著在固體表面的抗體或抗原。作為最敏感的免疫分析方法之一，ELISA在實驗室研究、疾病生物標(biāo)志物診斷和各個行業(yè)的質(zhì)量控制方面具有商業(yè)價值。
ELISA的主要類型
根據(jù)抗原固定策略、抗體標(biāo)記策略以及抗體-抗原反應(yīng)類型(直接識別或競爭)的不同，ELISA可以分為：
直接法、間接法、夾心法、競爭法。
直接法ELISA
直接法ELISA是的ELISA形式。抗原通過一段時間的孵化被動地附著在酶標(biāo)板孔底部。在簡單的洗滌步驟后，通過添加與酶共價連接的抗體來檢測抗原。孵化和洗滌后，通過添加色原/底物產(chǎn)生顏色變化。在一段時間后，或在規(guī)定時間通過化學(xué)方法停止酶活性后，在分光光度計中讀取顯色。
由于只涉及一個抗體，所以直接法ELISA適用于樣品中抗原的定性或定量檢測、抗體篩選和表位基因圖譜。這種方法沒有交叉反應(yīng)的二抗，可以在更短的時間內(nèi)進行檢測。然而，一抗的免疫反應(yīng)可能會受到酶標(biāo)記的不利影響。標(biāo)記的一抗不常用，因此使用直接法ELISA時，需要為每個特定的ELISA系統(tǒng)標(biāo)記一抗。
間接法ELISA
間接法ELISA檢測是在直接法ELISA的基礎(chǔ)上添加一個標(biāo)記二抗進行檢測，是目前的ELISA形式。抗原通過孵化被動地附著在孔上。洗滌后，抗原與抗原特異性抗體一起孵化。洗滌后，添加與酶共價連接的抗體，此抗體對第一次添加的抗體所產(chǎn)生的物種具有特異性，可以檢測所有結(jié)合的抗體。孵化和洗滌后，可以進行測試和讀數(shù)。
與直接法ELISA類似，間接法ELISA可用于抗體篩選、表位基因圖譜和蛋白質(zhì)定量檢測。二抗的作用是增強一抗的信號，使間接ELISA比直接ELISA更敏感。然而，它也會產(chǎn)生更高的背景信號，并可能降低整體信號。
夾心法ELISA
夾心法ELISA是最有用的免疫測定形式之一，它設(shè)計用于檢測可溶性抗原。根據(jù)使用的抗體數(shù)量，該ELISA有兩種形式。兩者的原理是相同的，一種是直接將抗原固定在固相上，另一種是將捕獲抗體固定在固相上以捕獲抗原。
? 直接夾心法ELISA(圖3a)中，捕獲抗體被附著在固相上。洗去多余的未結(jié)合抗體后，加入的抗原被特異性捕獲。然后用第二種酶標(biāo)記的抗體直接針對該抗原進行檢測。這種類型的檢測適用于有單一物種抗血清可用，且抗原不能很好地附著在板上時。
? 間接夾心法ELISA(圖3b)中，通過第二種未標(biāo)記的抗體來檢測抗原。該抗體則使用酶標(biāo)記的偶聯(lián)物來檢測。重要的是偶聯(lián)物不能與捕獲抗體結(jié)合，因此產(chǎn)生捕獲抗體的物質(zhì)必須是不同的。該方法的優(yōu)點是，可以使用單一的抗偶聯(lián)物來檢測任意數(shù)量樣品中抗體的結(jié)合。
這種方法適用于抗原被其他蛋白質(zhì)污染或低濃度時。在這些情況下，抗原不能以足夠高的濃度直接附著在固相上，以使用直接或間接ELISA進行檢測。夾心ELISA依賴于具有至少兩個抗原位點的抗原，以便至少兩個抗體群可以與之結(jié)合。
競爭法ELISA
直接法ELISA是的ELISA形式。抗原通過一段時間的孵化被動地附著在酶標(biāo)板孔底部。在簡單的洗滌步驟后，通過添加與酶共價連接的抗體來檢測抗原。孵化和洗滌后，通過添加色原/底物產(chǎn)生顏色變化。在一段時間后，或在規(guī)定時間通過化學(xué)方法停止酶活性后，在分光光度計中讀取顯色。
上述系統(tǒng)是ELISA的基本配置。所有這些都可以適用于使用競爭或抑制條件測量抗原或抗體，如圖4所述。隨著溶液中游離抗原(抗體)量的增加，將與固定基質(zhì)結(jié)合的抗體(抗原)量會減少。在洗滌步驟之后，添加發(fā)色團底物以產(chǎn)生信號(顏色變化或光)。抗體/抗原挑戰(zhàn)引起的信號變化揭示了競爭性抗原/抗體的信息。樣品中的抗原越多，最終孔底結(jié)合的參照抗原的抗體就越少，信號就越弱。
將可能含有抗原的未知樣品與含有已知量純化抗原的類似樣品進行比較時，競爭法ELISA適用于測量復(fù)雜混合物中的抗原濃度。
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